趙新燕 周建民 秦學(xué)

（聊城萬合工業(yè)制造有限公司，山東 聊城252022）

冬凌草為唇形科植物碎米椏[Rabdosia rubescens(Hamst)C.Y.Wu.et Hsuan]的干燥地上部分，主要分布于我國(guó)黃河流域及其以南各地區(qū)，主產(chǎn)于河南太行山南麓各地。冬凌草具清熱解表、消炎止痛、健胃活血等功效，在抗腫瘤方面有較強(qiáng)的活性。冬凌草甲素為冬凌草的有效活性成分，研究^[1]發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)在河南濟(jì)源太行山區(qū)8月份冬凌草葉中冬凌草甲素含量最高，它是一種對(duì)映貝殼杉烯二萜類化合物。

冬凌草甲素對(duì)各種移植性腫瘤細(xì)胞具有較大的殺傷，抑制增殖能力，臨床上主要用來治療胃癌、食道癌等癥。冬凌草甲素目前主要從冬凌草植物中分離純化得到，提取方法主要為乙醚提取法、乙醇提取法及中壓柱色譜法等，但這些提取工藝操作周期長(zhǎng)，條件不易控制，得到的冬凌草甲素的含量低^[2-5]。

本文采用反相制備色譜法分離純化了冬凌草甲素，分離工藝簡(jiǎn)單，提取率高，所得產(chǎn)品純度高，無污染，為進(jìn)一步工業(yè)化制備型液相色譜分離純化冬凌草甲素提供了基礎(chǔ)。

1  儀器與試藥

高效液相色譜儀含GLP3250泵，可更換泵頭兩個(gè)（250ml）,GLP色譜工作軟件，UC-3292檢測(cè)器；超聲清洗機(jī)，PH測(cè)定儀。試劑：甲醇，純水，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇（均為分析純）；冬凌素甲素對(duì)照品由河南醫(yī)科提供經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)純度大于99.5%；冬凌草產(chǎn)自河南濟(jì)源市。

2  制備條件

分析條件：色譜柱（ID4.6×250mm，C18,粒徑5μm）；流動(dòng)相：甲醇—水（60：40）；柱溫：38℃，流速：1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：239nm；進(jìn)樣體積10μl。

制備條件：色譜柱（ID63×700mm，Diamonsil C18,粒徑25~40μm）；流動(dòng)相：甲醇—水（55:45）；流速：35ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：239nm；進(jìn)樣體積5ml。

3  冬凌草甲素的制備

3.1 樣品的處理

參考文獻(xiàn)^[6-7]并考慮到各種成本，選用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇進(jìn)行熱回流提取。取冬凌草干草粉末120g，放到預(yù)熱至80℃的1200ml 95%熱乙醇中，保溫回流30min，過濾得提取液。將沉淀再次提取2次，將所有提取液濃縮成膏，即粗品。

3.2  冬凌草甲素的純化

將上節(jié)方法制備的冬凌草甲素粗品用制備條件中的流動(dòng)相配制成體積10mL的溶液，用0.45 μm孔徑的濾膜過濾，作為制備液備用。在2節(jié)制備色譜條件下開機(jī)，每次進(jìn)樣5ml，收集相應(yīng)的流出液，蒸發(fā)濃縮干燥，得冬凌草甲素白色粉末。

3.3  制備樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

用萬分之一電子天平準(zhǔn)確稱取上節(jié)制得的冬凌草甲素5mg，用分析色譜條件流動(dòng)相溶解，定容于25mL容量瓶中，按照反相高效液相色譜測(cè)定法^[8]進(jìn)行純度測(cè)定，制備的樣品冬凌草甲素質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99%。

4  結(jié)果與討論

4.1  流動(dòng)相的選擇

流速35ml/min，進(jìn)樣量5ml，考察不同組成流動(dòng)相下的分離效果和回收率，結(jié)果如表1所示。由表1可見，隨著溶劑極性的增大，分離度、保留時(shí)間及冬凌草甲素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增大，而回收率逐漸減少，綜合分析，選擇甲醇：水為55:45的溶劑體系作為流動(dòng)相。

4.2  流速的選擇

以甲醇-水（55:45）作為流動(dòng)相，進(jìn)樣體積為5ml，測(cè)試了流速分別為20、25、30、35、40、45、50ml/min條件下的樣品分離度、保留時(shí)間及純度，結(jié)果如表2。由表2可見，隨著

表1  流動(dòng)相組成對(duì)分離冬凌草甲素的影響

表2  流動(dòng)相的流速對(duì)分離冬凌草甲素的影響

流速的增大，冬凌草甲素的保留時(shí)間逐漸減少，分離度降低，樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增大后減小，在流速大于35ml/min的條件下，樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降。綜合考慮分離周期、分離度等，選擇以35ml/min為流動(dòng)相的流速。

4.3  進(jìn)樣質(zhì)量濃度的選擇

以甲醇-水（55:45）作為流動(dòng)相，流速控制在35ml/min，測(cè)試了樣品在不同進(jìn)樣質(zhì)量濃度下的分離效果，結(jié)果見表3.由表3可見，隨著進(jìn)樣質(zhì)量濃度的增大，色譜保留時(shí)間增長(zhǎng)，色譜寬度變大，分離度減小，冬凌草甲素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。為保證有較高的生產(chǎn)效率，較高的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，選擇進(jìn)樣質(zhì)量濃度為15g/ml。

表3  進(jìn)樣質(zhì)量濃度對(duì)分離冬凌草甲素的影響

5  結(jié)論

采用制備液相色譜法分離純化冬凌草甲素，分離效果好，分離周期短，所用溶劑對(duì)環(huán)境無污染。本工藝若120g冬凌草可提取得370mg冬凌草甲素，收率高，可供工業(yè)化生產(chǎn)工藝參考。

參考文獻(xiàn)

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